Vökvaskiljun er aðalaðferðin til að prófa innihald hvers efnisþáttar og óhreininda í hráefnum, milliefni, efnablöndur og umbúðaefni, en mörg efni hafa ekki staðlaðar aðferðir til að styðjast við og því er óhjákvæmilegt að þróa nýjar aðferðir. Við þróun vökvafasaaðferða er litskiljunarsúlan kjarninn í vökvaskiljun, svo hvernig á að velja viðeigandi litskiljunarsúlu skiptir sköpum. Í þessari grein mun höfundur útskýra hvernig á að velja vökvaskiljunarsúlu úr þremur þáttum: heildarhugmyndum, hugleiðingum og notkunarsviði.
A. Heildarhugmyndir um val á vökvaskiljunarsúlum
1. Metið eðlis- og efnafræðilega eiginleika greiniefnisins: eins og efnafræðileg uppbygging, leysni, stöðugleiki (eins og hvort auðvelt sé að oxa/minnka/vatnsrof), sýrustig og basa osfrv., sérstaklega efnafræðileg uppbygging er lykillinn. þáttur í að ákvarða eiginleika, eins og samtengdi hópurinn hefur sterka útfjólubláa frásog og sterka flúrljómun;
2. Ákvarða tilgang greiningarinnar: hvort þörf er á mikilli aðskilnað, mikilli dálka skilvirkni, stuttan greiningartíma, mikið næmi, háþrýstingsþol, langan dálkalíf, lágan kostnað osfrv.
- Veldu viðeigandi litskiljunarsúlu: skildu samsetningu, eðlisfræðilega og efnafræðilega eiginleika litskiljunarfylliefnisins, svo sem kornastærð, svitaholastærð, hitaþol, pH-þol, aðsog greiniefnisins osfrv.
- Hugleiðingar um val á vökvaskiljunarsúlum
Í þessum kafla verður fjallað um þá þætti sem þarf að hafa í huga þegar litskiljunarsúla er valin út frá eðlis- og efnafræðilegum eiginleikum sjálfrar litskiljunarsúlunnar. 2.1 Fyllingarfylki
2.1.1 Kísilgelfylki Fylliefni flestra vökvaskiljunarsúlna er kísilgel. Þessi tegund af fylliefni hefur mikinn hreinleika, lítinn kostnað, mikinn vélrænan styrk og auðvelt er að breyta hópum (svo sem fenýltengi, amínótengi, sýanótengingu osfrv.), En pH gildi og hitastig sem það þolir eru takmörkuð: pH-svið flestra kísilgelfylliefna er 2 til 8, en pH-svið sérbreyttra kísilgelbundinna fasa getur verið allt að 1,5 til 10, og það eru einnig sérbreyttir kísilgeltengdir fasar sem eru stöðugir við lágt pH, eins og Agilent ZORBAX RRHD stablebond-C18, sem er stöðugt við pH 1 til 8; efri hitastigsmörk kísilgelfylkisins eru venjulega 60 ℃ og sumar litskiljunarsúlur geta þolað 40 ℃ hitastig við hátt pH.
2.1.2 Fjölliða fylki Fjölliðufylliefni eru aðallega pólýstýren-dívínýlbensen eða pólýmetakrýlat. Kostir þeirra eru að þeir þola breitt pH-svið - þeir geta verið notaðir á bilinu 1 til 14, og þeir eru ónæmari fyrir háum hita (geta náð yfir 80 °C). Í samanburði við C18 fylliefni sem byggir á kísil, hefur þessi tegund af fylliefni sterkari vatnsfælni og stórpora fjölliðan er mjög áhrifarík við að aðskilja sýni eins og prótein. Ókostir þess eru að súlunýtingin er minni og vélrænni styrkurinn er veikari en fylliefna sem byggjast á kísil. 2.2 Agnaform
Flest nútíma HPLC fylliefni eru kúlulaga agnir, en stundum eru þær óreglulegar agnir. Kúlulaga agnir geta veitt lægri súluþrýsting, meiri dálka skilvirkni, stöðugleika og lengri líftíma; þegar hreyfanlegur fasa með mikilli seigju (eins og fosfórsýra) er notaður eða þegar sýnislausnin er seigfljótandi, hafa óreglulegar agnir stærra tiltekið yfirborðsflatarmál, sem stuðlar að fullri virkni þessara tveggja fasa, og verðið er tiltölulega lágt. 2.3 Kornastærð
Því minni sem kornastærðin er, því meiri er súluafköst og því meiri aðskilnaður, en því verri er háþrýstingsþolið. Algengasta súlan er 5 μm kornastærðarsúlan; ef aðskilnaðarþörfin er mikil er hægt að velja 1,5-3 μm fylliefni, sem er til þess fallið að leysa aðskilnaðarvandamál sumra flókinna fylkis- og fjölþátta sýna. UPLC getur notað 1,5 μm fylliefni; 10 μm eða stærri fylliefni kornastærðar eru oft notuð fyrir hálfundirbúandi eða undirbúningssúlur. 2.4 Kolefnisinnihald
Kolefnisinnihald vísar til hlutfalls bundins fasa á yfirborði kísilhlaups, sem tengist tilteknu yfirborði og þekju bundins fasa. Hátt kolefnisinnihald veitir mikla dálkagetu og mikla upplausn og er oft notað fyrir flókin sýni sem krefjast mikillar aðskilnaðar, en vegna langs víxlverkunartíma milli fasanna tveggja er greiningartíminn langur; litskiljunarsúlur með lágt kolefnisinnihald hafa styttri greiningartíma og geta sýnt mismunandi sértækni og eru oft notaðar fyrir einföld sýni sem krefjast hraðrar greiningar og sýni sem krefjast mikils vatnsfasaskilyrða. Almennt er kolefnisinnihald C18 á bilinu 7% til 19%. 2.5 Svitaholastærð og tiltekið yfirborð
HPLC aðsogsmiðlar eru gljúpar agnir og flestar víxlverkanir eiga sér stað í svitaholunum. Þess vegna verða sameindir að komast inn í svitaholurnar til að aðsogast og aðskiljast.
Svitaholastærð og sérstakt yfirborðsflatarmál eru tvö viðbótarhugtök. Lítil svitaholastærð þýðir stórt tiltekið yfirborð og öfugt. Stórt tiltekið yfirborð getur aukið víxlverkun sýnissameinda og tengdra fasa, aukið varðveislu, aukið hleðslu sýnis og súlugetu og aðskilnað flókinna íhluta. Alveg gljúp fylliefni tilheyra þessari tegund fylliefna. Fyrir þá sem eru með miklar aðskilnaðarkröfur er mælt með því að velja fylliefni með stórt tiltekið yfirborð; Lítið sérstakt yfirborð getur dregið úr bakþrýstingi, bætt skilvirkni dálka og dregið úr jafnvægistíma, sem er hentugur fyrir hallagreiningu. Kjarna-skel fylliefni tilheyra þessari tegund fylliefna. Á þeirri forsendu að tryggja aðskilnað er mælt með því að velja fylliefni með litlu tilteknu yfirborði fyrir þá sem hafa miklar kröfur um skilvirkni greiningar. 2.6 Svitarúmmál og vélrænn styrkur
Svitarúmmál, einnig þekkt sem „holarúmmál“, vísar til stærðar tómarúmmáls á hverja einingu agna. Það getur vel endurspeglað vélrænan styrk fylliefnisins. Vélrænni styrkur fylliefna með mikið holarúmmál er aðeins veikari en fylliefna með lítið holarúmmál. Fylliefni með holurúmmál minna en eða jafnt og 1,5 ml/g eru aðallega notuð fyrir HPLC aðskilnað, en fylliefni með hola rúmmál meira en 1,5 ml/g eru aðallega notuð fyrir sameindaútilokunarskiljun og lágþrýstingsskiljun. 2.7 Þakhlutfall
Lokun getur dregið úr skottoppum sem orsakast af víxlverkun efnasambanda og óvarinna síanólhópa (svo sem jónatengi milli basískra efnasambanda og síanólhópa, van der Waals krafta og vetnistengis milli súrra efnasambanda og síanólhópa), og þar með bætt súluskilvirkni og toppform. . Ótengdir bundnir fasar munu framleiða mismunandi sértækni miðað við lokuð tengt fasa, sérstaklega fyrir skautsýni.
- Umfang notkunar mismunandi vökvaskiljunarsúlna
Þessi kafli mun lýsa notkunarsviði mismunandi gerða af vökvaskiljunarsúlum í sumum tilvikum.
3.1 Reversed-phase C18 litskiljunarsúla
C18 súlan er algengasta öfugfasa súlan sem getur staðist innihalds- og óhreinindapróf flestra lífrænna efna og á við um meðalskauta, veikskautaða og óskautaða efni. Gerð og forskrift C18 litskiljunarsúlunnar ætti að vera valin í samræmi við sérstakar aðskilnaðarkröfur. Til dæmis, fyrir efni með miklar aðskilnaðarkröfur, eru 5 μm*4,6 mm*250 mm forskriftir oft notaðar; fyrir efni með flókin aðskilnaðarfylki og svipaða pólun er hægt að nota 4 μm*4,6 mm*250 mm forskriftir eða minni kornastærðir. Til dæmis notaði höfundur 3 μm*4,6 mm*250 mm súlu til að greina tvö erfðaeituruð óhreinindi í celecoxib API. Aðskilnaður efnanna tveggja getur náð 2,9, sem er frábært. Að auki, undir þeirri forsendu að tryggja aðskilnað, ef þörf er á hraðri greiningu, er stutt súla 10 mm eða 15 mm oft valin. Til dæmis, þegar höfundur notaði LC-MS/MS til að greina erfðaeituruð óhreinindi í piperaquine fosfat API, var notuð 3 μm*2,1 mm*100 mm súla. Aðskilnaður milli óhreininda og aðalþáttar var 2,0 og hægt er að greina sýni á 5 mínútum. 3.2 Reversed-phase fenýlsúla
Fenýlsúla er líka tegund af öfugfasa súlu. Þessi tegund af súlu hefur mikla sértækni fyrir arómatísk efnasambönd. Ef svörun arómatískra efnasambanda mæld með venjulegri C18 súlu er veik, geturðu hugsað þér að skipta um fenýlsúluna. Til dæmis, þegar ég var að búa til celecoxib API, var svörun aðalþáttarins mæld með fenýlsúlunni frá sama framleiðanda og sömu forskrift (allar 5 μm*4,6 mm*250 mm) um það bil 7 sinnum meiri en C18 súlunnar. 3.3 Venjulegur-fasa dálkur
Sem áhrifarík viðbót við öfugfasa súlu, er venjulegur fasasúla hentugur fyrir mjög skautuð efnasambönd. Ef toppurinn er enn mjög hraður þegar skolað er með meira en 90% vatnsfasa í öfugfasa súlunni, og jafnvel nálægt og skarast við leysistoppinn, geturðu íhugað að skipta út normalfasa súlunni. Þessi tegund af dálki inniheldur hilic dálk, amínósúlu, sýanósúlu osfrv.
3.3.1 Hilic súla Hilic súla fellur venjulega vatnssækna hópa í tengda alkýlkeðjuna til að auka svörun við skautuðum efnum. Þessi tegund súlu hentar vel til greiningar á sykurefnum. Höfundur notaði þessa tegund dálka þegar hann gerði innihald og skyld efni xýlósa og afleiður þess. Ísómerur xýlósaafleiðu geta einnig verið vel aðskildar;
3.3.2 Amínósúla og sýanósúla Amínósúla og sýanósúla vísa til innleiðingar á amínó- og sýanóbreytingum í lok tengdu alkýlkeðjunnar, í sömu röð, til að bæta sértækni fyrir sérstök efni: til dæmis er amínósúla góður kostur til að aðskilja sykur, amínósýrur, basa og amíð; Sýanósúla hefur betri sértækni þegar aðskilin eru vetnuð og óvetnuð sambærileg efni vegna þess að samtengd tengi eru til staðar. Oft er hægt að skipta um amínósúlu og sýanósúlu á milli venjulegs fasasúlu og öfugfasa dálks, en ekki er mælt með tíðum skiptum. 3.4 Chiral dálkur
Chiral súla, eins og nafnið gefur til kynna, er hentugur fyrir aðskilnað og greiningu á chiral efnasamböndum, sérstaklega á sviði lyfja. Þessi tegund súlu er hægt að íhuga þegar hefðbundnar öfugfasa og venjulegir fasasúlur geta ekki náð aðskilnaði hverfa. Til dæmis notaði höfundur 5 μm*4,6 mm*250 mm kiral súlu til að aðskilja tvær hverfur 1,2-dífenýletýlendíamíns: (1S, 2S)-1, 2-dífenýletýlendíamíns og (1R, 2R)-1, 2 -dífenýletýlendiamíni, og aðskilnaðurinn á milli þeirra tveggja náði um 2,0. Hins vegar eru chiral súlur dýrari en aðrar gerðir af súlum, venjulega 1W+/stk. Ef þörf er á slíkum dálkum þarf einingin að gera nægilegt fjárhagsáætlun. 3.5 Jónaskiptasúla
Jónaskiptasúlur henta til að aðgreina og greina hlaðnar jónir, svo sem jónir, prótein, kjarnsýrur og sum sykurefni. Samkvæmt fylliefnisgerðinni er þeim skipt í katjónaskiptasúlur, anjónaskiptasúlur og sterkar katjónskiptasúlur.
Katjónaskiptasúlur innihalda súlur sem eru byggðar á kalsíum og vetni, sem henta einkum til greiningar á katjónískum efnum eins og amínósýrum. Til dæmis notaði höfundur kalsíumsúlur við greiningu á kalsíumglúkónat og kalsíumasetati í skollausn. Bæði efnin höfðu sterk svörun við λ=210nm og aðskilnaðarstigið náði 3,0; höfundur notaði vetnisdálka við greiningu á glúkósatengdum efnum. Nokkur helstu skyld efni – maltósi, maltótríósi og frúktósi – höfðu mikið næmi undir mismunaskynjara, með greiningarmörk allt að 0,5 ppm og aðskilnaðargráðu 2,0-2,5.
Anjónaskiptasúlur eru aðallega hentugar til greiningar á anjónískum efnum eins og lífrænum sýrum og halógenjónum; Sterkar katjónaskiptasúlur hafa meiri jónaskiptagetu og sértækni og henta vel fyrir aðskilnað og greiningu flókinna sýna.
Ofangreint er aðeins kynning á gerðum og notkunarsviði nokkurra algengra vökvaskiljunarsúlna ásamt eigin reynslu höfundar. Það eru aðrar sérstakar gerðir af litskiljunarsúlum í raunverulegum notkunum, svo sem litskiljunarsúlur með stórum porum, litskiljunarsúlur með litlum holum, sækniskiljunarsúlur, fjölhama litskiljunarsúlur, ofurafkastamiklar vökvaskiljunarsúlur (UHPLC), ofurkritískar vökvaskiljunarsúlur ( SFC), osfrv. Þeir gegna mikilvægu hlutverki á mismunandi sviðum. Sérstök gerð litskiljunarsúlu ætti að vera valin í samræmi við uppbyggingu og eiginleika sýnisins, aðskilnaðarkröfur og annan tilgang.
Pósttími: 14-jún-2024